摘要：生物样品分析是进行药代动力学（PK）、生物利用度（BA）、生物等效性（BE）研究及药代动力学（PK）/药效动力学（PD）分析的基础。本文针对目前申报资料中生物样品分析准确性方面存在的问题，分析探讨其产生的原因及改进措施，以期提高生物样品分析的质量。

生物样品分析是指对来自动物或临床的生物样本中的药物、代谢物、生物标志物的分析^[1]。本文探讨的问题主要涉及来自临床的血、尿样品的分析，这些问题同样也适用于临床前动物血、尿样品，以及来自动物和人体的其他样品，如粪便、组织、细胞等。

 在药品审评过程中，审评员经常会发现不符合常理的事情。如在真实性、方法学、测试批按照目前指导原则进行审评均不存在问题的前提下，就AUC均值而言，同一企业的药品作为参比制剂（批号不同）在同一试验单位测试，前后获得的数据最大会相差6倍；同一企业的试验药品，同一批号、同一剂量，在两个单位按照相同条件分别试验和测试，提供的AUC均值数据相差近2倍。

以上个例所反映的情况为数据准确性的问题。究竟是那些因素导致了这些问题，解开这个谜团的最直接的方法是对出现问题的样品重新进行分析，看看究竟是哪方面出现了问题，是标准品的问题、测试问题还是确实是受试者自身的差异造成的？但实际上，重复测定存在着很多困难，提交资料的单位有时早期并不知道数据的差异，待审评中心发现这个问题时，时间已经过去很久，保存的样品不能确定是否还稳定，再分析失去了意义；另外，这其中还涉及到经费、方法重现等问题。因此，目前多数还无法知道其中的确切原因。

药代动力学、生物等效性研究的指导原则已经颁布多年^[2,3]，被国内单位所广泛接受。在进行生物样品测定时，首先应建立分析方法，并按照要求进行方法学考核，只有考核通过时，才能进行样品测试。方法学考核时要求考察专属性、线性、最低定量限、回收率、稀释完整性（必要时）、基质效应、稳定性等。但要注意，在考核过程中，如果标准品纯度有误或未加校正、配制的母液浓度错误、天平或容器计量不准、使用与测试基质不同的空白生物样品基质（如临床上用的成份血浆做方法学考核的空白基质）、线性和质控样配制不规范等，这些问题均不会影响方法学考核的通过和样品测试结果批符合要求，但均可以造成准确度的巨大差异。

准确的数据是一切分析的基础，不准确的数据会产生严重的误导作用，造成时间、金钱的浪费，甚至导致本可以上市的药物被拒批。例如，对于浓度依赖性抗菌药物，如果AUC测定不准确，则不能正确地通过AUC/MIC比值来确定最佳给药剂量；再例如，注册分类3药品的PK桥接研究，在没有国外人群作为参比的情况下，如果存在测定结果的不准确，则不易正确判断种族差异的大小，无法桥接国外丰富的临床研究数据。创新药物的开发过程中，需要沿着安全有效、质量可控这条主线逐步推进，临床前和临床研究均需要为这一主线服务，各种数据互相佐证、形成证据链，最大可能地揭示药物在体内的作用规律，支持新药上市。而在这一过程中，大量未知因素掺杂其中。一般可通过固定可控因素，暴露不可控因素，寻找其中的规律。如果掺入数据不准确这一实际上可以控制的因素，除不利于原因分析外，还会误导决策人和审评人，长期下去会严重阻碍新药研究和评价质量的提高。

（一）原因分析和策略

出现以上准确性问题，其原因是多方面的，有的原因已知，有的原因未知。因此，采取的对策可以是针对性的，也可以是预防性的。依据作者经验，建议如下策略，供申办者和研究单位参考。    

1、参照药物临床试验生物样本分析实验室管理指南（试行）的要求，对比本单位的不足并加以改进；建立和健全独立运行的质保体系，使质保真正地在试验前、试验中、试验后发挥作用，而不是走过场。     

2、生物样品测试承担单位应积极分析数据差异的原因，尤其是一个单位前后时间承担了同一个项目时。获得的数据要进行多方面对比，如与原研企业、国内外文献、本单位以往获得的结果进行对比，如出现了较大的差异，应积极分析其原因并加以克服，并在今后的试验中避免再次发生。  

 3、测试人员应相对固定，对人员流动比较大的单位，如一些高校单位、合同研究单位，承担样品分析的负责人要采取措施保证一个分析项目中测试人员相对稳定，且对加入的新人需要经过培训、能力测试等措施后方可以安排其测试任务。

4、对于样品采集与测试不在一地进行或样品转移时间比较长时，申办者或研究单位应有相应措施保证样品在转移过程的稳定并用数据说明。

5、对于样品分析跨度时间比较长或多个相关试验同时或先后进行时，申办者应采取措施保证不同时间、不同地点的试验结果的一致性。一般情况下，不建议频繁更换样品测试单位，确实需要更换时，应进行实验室比对试验（样品互测），确保试验数据的一致性；使用不同的方法进行测定时，建议进行交叉验证。

6、由于测试单位提供的数据可以作为支持新药上市的依据，承担测试的试验单位应确保当试验数据与申办者利益出现冲突时能够处在公正立场，为数据质量负责，而不是为试验结果负责，杜绝造假事件和提供虚假数据的发生。

（二）提高研究数据质量的经验介绍

1、仪器状态：生物样品分析需要极高的灵敏度和准确度，涉及的仪器，其状态必须处于最佳状态，且多数仪器需要计量认证，必要时还可以进行3Q认证（IQ/OQ/PQ）。

2、对照品（标准品）：首选国家对照品（标准品）；对于从试剂公司购买、自制的对照品要保证批次之间的一致性，提供分析证书；一般情况下，不用自身制剂作为对照品。用对照品计算储备液的浓度时，除含量折算外，还需注意是否需要扣去盐基、水份。如用原料药做对照品，原料药检验报告中的含量，往往是以干品计，已经去掉了水份，而称量时必须考虑到水份的影响。对照品开封后应尽快使用，避免吸潮和分解。对于开展周期比较长的临床试验，对照品的批次不要更换太频，在保证稳定的情况下，尽量使用同一批对照品，这要求一次要购买或制备足够量的对照品。

3、计量容器的准确性：试验中使用的各种计量容器要定期校准、专人专用，如开展一个新的试验时，可以将要使用的计量容器全部重新校准一遍。称量时要考虑天平的感量，如万分之一天平适合称量10mg以上的重量，1mg的重量需要百万分之一天平称量。

4、考核用的生物基质应与样品基质一致：与化学分析不同，生物样品的分析必须考虑生物基质的影响，特别是目前使用LC-MS/MS越来越多的情况下。不同基质其离子化效率差别很大，需要在研究中保持生物基质的来源和含量一致，如成份血、动物血不能用来代替临床受试者的血样进行方法学考察，血清和血浆也不能互相替代，也不能用稀释后的血浆代替正常人血浆。在不同来源血浆（清）的专属性、基质效应等考察中要清楚地标明其来源。  

5、线性和质控样配制的规范化问题：这也是目前出现问题比较多的地方，也可能是影响数据准确度的一个非常重要因素。方法学考核的目的是用含药的血浆（清）来模拟实际样品的情况，因此，模拟样和待测样的基质种类及其含量要严格一致。目前申报资料中，制备模拟样主要有四种方法：①将一定体积的工作液加入到生物基质中，之后用生物基质进行稀释获得不同浓度的模拟样，然后等份；②将贮备液稀释成不同的浓度工作液，临用时取同样体积的工作液加入到生物基质中制备成不同浓度的线性和质控模拟样，没有等份；③将不同浓度的工作液加入到试管中吹干，然后再加入固定体积的生物基质，振摇使残渣溶解；④将贮备液稀释成不同浓度的工作液，取同样体积的工作液加入到同样体积的生物基质中制备成不同浓度的模拟样，然后等份。以上几种方法均有其优缺点，方法①需要注意加入溶剂的体积比例，第一个点一般应控制在5%以下，且不同浓度的模拟样含有溶剂的比例是不一样的，第一个点稀释时溶剂含量最大。过多的溶剂，如甲醇，可以使蛋白变性，造成药物被吸附或包裹，使整个浓度范围出现误差。方法②制备的模拟样，现用现配时，待测物溶液中的成份和血浆（清）之间可能没有达到平衡即被进入下一步处理，如沉淀或萃取，造成回收率结果虚高；进行生物样品稳定性考察时，需要考虑终体积和溶剂比例。如样品处理时，使用100μl血浆，则最好用等份的100μl血浆质控来进行模拟。如果质控样用100μl血浆+20μl待测物溶液（溶剂含量16.7%，过高）来模拟，因实际生物样品中并没有这20μl溶剂，且终体积为120μl，使用这种模拟样获得的稳定性数据就不能代表实际样的稳定性情况。另外，使用这种方法进行方法学考核和样品测试时应保持严格的平行操作（临床样品需要补充同体积的溶剂）；方法③在吹干过程中有可能造成待测物损失，残渣溶解得也可能不彻底。方法②、③均需要注意所制备的贮备液的稳定性。用同一个贮备液制备的线性和质控样，即使贮备液的浓度发生很大变化，其线性和质控数据是不受影响的。方法④为比较规范的线性和质控样品制备方法，注意控制溶剂含量在5%以内。方法①、④使用空白生物基质较多，方法②、③比较节省空白生物基质。另外，还应注意加入质控样的目的是保证所建立的方法的可靠性，目前的指导原则只是推荐由不同人制备，从提高数据质量来看，应要求由不同人从称量开始进行质控样配制，这其中包括LLOQ样的配制。配制的质控样的浓度尽量与线性样有区别，以提高质控样的质控作用。配制的质控浓度QCL应在3倍的LLOQ浓度以内，QCM应在线性范围的几何或算术平均值的40~60%，QCH应为线性上限的75~90%。质控样一次配制可以适当多些，不同批次的质控样有时还需要在一个分析批内测定，以比较其浓度是否有明显差异。

6、内标和最低定量限问题：内标的浓度要兼顾待测物的含量高低，不能太高和太低，太高时造成峰面积比值很小，易受有效数字的影响；太低时易受基线噪音的影响，应保证S/N>20。专属性考察时，不同来源生物样品的干扰峰面积应小于LLOQ样峰面积的20%。交叉干扰峰面积也应小于LLOQ样峰面积的20%或保证S/N＞5。在进行最低定量限确定时，应考虑仪器使用过程中灵敏度下降的因素，S/N应留有一定的冗余度，以便即使灵敏度下降后其S/N值还能够符合要求。内标选择时，液质联用方法推荐选择高纯度的稳定同位素标记的内标。

7、系统适应性和研究者能力考核：每一批分析前推荐使用不同的样品溶液进行系统适用性试验。有的研究使用不含生物基质的LLOQ溶液；有的使用LLOQ、ULOQ、空白样。主要目的是考核仪器的灵敏度、分离度、峰形、信噪比、噪音水平、交叉污染情况等。另外，参加样品分析的研究者，即使经验非常丰富， 在进行一个新的研究项目时，还是应该注意进行研究能力的考核。在审评时，对比研究者提交的前后分析数据，有时会发现，前几批测试数据变异明显高，后几批逐渐趋于正常，其原因可能与早期研究者操作不熟练有关。

8、转移样品的稳定性问题：目前开展的许多BE、PK试验，样品采集和测试在不同的单位进行。有时两单位相距很远，甚至将样品送到国外测试。样品转移的时间数小时或数天不等。由于生物样品的特殊性，在常温下，有些成分会迅速降解，导致测试数据失真。在此种情况下，除了制定质保措施外，还需要用数据说明整个样品在转移过程中是稳定的。

9、分析批序列：随着高灵敏度仪器的使用，进样之间的交叉污染成为一个重要的污染源，需要在方法学考核和测试中时刻进行控制，可以在分析批运行前和运行中进行考核。目前许多申报单位在进行方法学考核时将5或6个同浓度的质控样一起测定，如先测6个QCL，再测6个QCM，之后再测6个QCH，这种做法交叉污染小，获得数据的一致性会明显很好，但该数据并不反映实际样品批测试中交叉污染情况。正确的做法应是将不同浓度的质控样品交叉进样，从而在交叉污染存在的情况下，比较各个质控浓度点测试的准确度和精密度。必要时在方法学中进行残留试验考察，即在测试中，线性高浓度点进样后，接着进一个空白样，根据空白样图谱中残留的大小确定所建方法的交叉污染是否合适。越来越多的研究显示，交叉污染的大小是评价分析批质量的关键因素之一，在方法学考核时应作为一项指标加以考核 ^[4]。

10、样品复测：除了在一些规定的情况下对已分析的样品进行复测外，有时要在分析计划中做出规定，专门进行一定量的样品复测。在实际分析中，研究者往往发现质控样重复测定的一致性并不代表实际样品的测定结果也是一致的。因此，在样品测试中，对分析计划规定的样品进行复测，然后比较两次测定的结果，可以验证方法学的重复性情况。如果方法学确实可行，则应该可以获得一致的重复测定结果。

11、分析方法转移后的再现、实验室间比对：目前申办者开展的一个新药研发项目，测试部分往往安排在几个单位进行，此时，有必要进行分析方法转移后的再现考核。有时还需要进行实验室间比对试验，保证后一个实验室的结果与前一个实验室的结果具有一致性，这是目前临床试验中亟需加强的一项任务。

12、交叉考核：当涉及两种或以上方法进行测试时，有必要进行交叉考核，确保两种方法测试数据的一致性^[5]。

13、样品采集的问题：生物样品测定结果不准确的问题还可能来自样品采集过程，涉及到试验过程是否规范（尽量避免采血前受试者刚刚用完餐或大量饮水）、采样时间是否准确、留置针采样时是否去除了残留血样的污染、血浆或血清离心是否及时、有无溶血、是否避光操作、获得的生物样品是否及时冻存等；对于尿液涉及时间段和体积记录是否准确、留样前混合是否均匀、长时间段的尿样是否冷藏保存等。

14、参加实验室之间考核：根据承担的测试项目不同，一定时期内参加权威机构的盲样测试，以评价该实验室的测试水平，是一种较好的提高测试准确性的方法。但目前国内还缺乏此类机构，希望有关单位予以重视。

我国医药工业“十二五”发展规划的主要任务中，增强新药创制能力、提升药品质量安全水平，均与临床研究的数据质量有关系。应该重视申报数据的质量，并把此项工作当成提高临床研究质量的大事来抓。如果各方面共同行动，相信分析测试的数据质量在未来不长时间内会有一个质的飞跃。近期颁布实施的药物临床试验生物样本分析实验室管理指南（试行）^[1]，从设施、仪器、人员、规范化操作、质量保证体系方面做出了严格的规定，一定程度上会帮助数据准确性的提高。

在创新药物研发过程中，保持生物样品测试的前后准确和一致性，是临床试验快速推进的保证。在此，提醒注册申请人和试验研究者在试验过程中采取各种措施保证获得的试验数据质量，这对涉及跨年度、多地才能完成的临床试验尤为关键。在试验过程中，对出现的问题及时分析和排除，最大限度、准确无误地揭示药物在人体内的作用规律，才能为药物的安全性和有效性评价提供可靠支撑。

国内相关指导原则颁布较早，在方法学考核及质量保证体系方面要求尚不完善，生物样本分析时不能仅满足于按照指导原则要求进行做作业式的考核，生物样品分析的承担单位应主动分析可能出现的各种各样问题并加以验证解决，为提高我国药品研究水平和提高上市药品质量做出应有的贡献。

参考文献

1.国家食品药品监督管理局. 药物临床试验生物样本分析实验室管理指南（试行）国食药监注字[2011]482号
2.国家食品药品监督管理局. 化学药物临床药代动力学研究技术指导原则. 2005.
3.国家食品药品监督管理局. 化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则.  2005.
4.European Medicines Agency. Guideline on validation of bioanalytical methods. www.ema.europa.eu/pdfs/human/ewp/19221709en.pdf. 2009.
5.U. S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Veterinary Medicine(CVM), Guidance for industry, Bioanalytical method validation. www.fda.gov/cvm. May 2001